Pewarnaan Gram

 PEWARNAAN GRAM

I . Tujuan

Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. 

II. Prinsip

1. Teknik Aseptis
   Cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan ( Siswaya, 2014 ).

2. Pewarnaan Diferensial
   Memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro, 2005).

3. Ikatan Ion

   Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna ( Volk & Wheeler, 1984 ).

4. Absorbsi
   Proses pemisahan bahan dari suatu campuran gas dengan cara pengikatan bahan tersebut pada permukaan absorben cair yang diikuti dengan pelarutan. Kelarutan gas yang akan diserap dapat disebabkan hanya oleh gaya-gaya fisik (pada absorpsi fisik) atau selain gaya tersebut juga oleh ikatan kimia (pada absorpsi kimia) ( Setyowati, 2009 ). 

III. Teori Dasar

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia (Karmana,2008).

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negatif misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium sp, karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaantersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2002).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 2005). 

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro, 2005).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro, 2005).

Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat, sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol (Fardiaz, 1989).

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikering anginkan. Kemudian digenangi lagi dengan safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan kering di udara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif (Pelczar, 2007).

Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram- negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies gram- negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif. Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif sering bersifat toksik (racun), dan membran bagian luar membantu melindungi bakteri gram-negatfi patogen melawawn sistem pertahanan inangnya. Lebih jauh, bakteri gram negatif umumnya lebih resisten terhadap antibiotik dibandingkan dengan gram-positif karena membran bagian luar itu mengahalangi masuknya obat-obatan ( Campbell, 2003 ).

Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tebal. Bakteri ini akan berwarna ungu jika diwarnai dengan pewarnaan Gram. Contohnya Neisseria gonnorrhoaeae, Treponema pallidum, Vibrio Cholerae dan Bacillus subtilis. Sedangkan Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tipis. Bakteri ini akan berwarna merah muda atau merah, kila diwarnai dengan pewarnaan gram. Contohnya Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (Aryulina, 2004).

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994).

IV. Alat dan Bahan

1. Alat :

   1. Bak Pewarna.

   2. Buku Gambar

   3. Cawan Petri

   4. Kaca Objek.

   5. Kapas.

   6. Kertas Saring.

   7. Korek api

   8. Mikroskop Majemuk.

   9. Ose.

   10. Pembakar Spirtus.

   11. Pensil warna Merah, Biru, Ungu

   12. Spidol

2. Bahan :

   1. Air Suling dalam Botol Semprot.

   2. Alkohol 70%.

   3. Alkohol 95%

   4. Desinfektan.

   5. Emersi Oil.

   6. Sampel Air Liur.

   7. Suspensi Campuran Bakteri E. coli dan S. Aureus

   8. Suspensi Campuran Bakteri E. coli dan B. subfilis

   9. Zat Warna Karbol Fuksin.

   10. Zat Warna Karbol Gentian Violet

   11. Zat Warna Lugol. 

 

V . Prosedur

Sampel suspensi bakteri di siapkan di dalam tabung reaksi. Kaca objek di sterilisasi dengan cara dicuci, lalu dimasukkan kedalam larutan desinfektan, kemudian dimasukkan kedalam larutan alkohol 70%. Setelah kaca objek disterilisasi, di lap menggunakan kapas sampai mengeluarkan suara berdecit. Lingkari bagian bawah kaca objek dengan spidol sebagai area untuk pengolesan sampel bakteri. Ose difiksasi dengan cara dibakar dengan pembakar spirtus sampai ose berpijar. Ose didinginkan dengan cara didekatkan dengan pembakar spirtus.

Dibuat olesan bakteri dari suspensi bakteri di atas kaca obyek yang bersih serta bebas lemak dengan menggunakan ose yang sudah di fiksasi. Setelah pengolesan, kaca objek di lewatkan di atas api pembakar spirtus sampai sampel di atas kaca objek berubah warna menjadi pucat (keputih – putihan).

Kemudian letakkan kaca objek di atas bak warna, genangi olesan tersebut dengan pewarna karbol gentian violet selama 1 menit, buang zat warna yang berlebih, lalu dibilas dengan air suling. Genangi olesan dengan lugol selama 2 menit, buang lugol yang berlebih lalu bilas dengan air suling. Cuci olesan dengan pemucat alkohol 95% tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna larut, lalu bilas dengan air suling. Genangi olesan dengan pewarna tandingan air fuksin selama 30 detik, buang warna yang berlebih, bilas dengan air suling lalu keringkan dengan kertas saring.

Teteskan sedikit minyak emersi pada gelas objek, lalu di periksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 10X dan 100X. Diamati dan digambar hasilnya.

VII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.

Pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara di celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan kedalam alkohol 70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada pembakar spiritus yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak tercampur dengan bakteri yang akan di uji.

Sebelum melakukan pengolesan bakteri kaca objek di beri tanda lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk melakukan pengolesan sel bakteri dari suspensi. Pada percobaan kali ini pengolesan di lakukan dua kali dengan sampel suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus & suspensi campuran Bakteri E. coli dan B. subfilis.

Kemudian melakukan pengolesan pada kaca objek dengan salah satu sampel suspensi campuran bakteri, setelah itu di fiksasi di atas api dengan cara di lewat – lewatkan tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati. Fiksasi dalam tahap ini bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya, mempermudah pengecetan,dan sediaan tahan untuk disimpan jika belum sempat dicat.

Kaca objek yang sudah dioleskan bakteri kemudian di simpan di atas bak warna lalu di teteskan pewarna karbol gentian violet dan diamkan selama 1 menit. Karbol gentian violet merupakan campuaran fuchsin fenol, dan dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba. Setelah 1 menit lalu di bilas dengan aquades. Lalu olesan di teteskan pewarna lugol dan diamkan selama 2 menit. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol akan terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif. Setelah 2 menit, lugol di bilas dengan aquades. Kemudian olesan dicuci dengan alkohol 95% sampai zat warna larut. Alkohol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci atau tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Setelah pemberian alkohol 95% olesan diberikan atau di teteskan pewarna tandingan berupa karbol fuksin selama 30 detik. Karbol fuksin ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Setelah 30 detik bilas dengan aquades lalu dikeringkan dengan kertas saring. Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.

Selanjutnya olesan di tetesi emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air, sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak emersi.

Dari hasil pengamatan mikroskop sampel suspensi campuran bakteri E. coli dan S. Aureus dapat teramati dengan ciri S. Aureus berbentuk coccus dengan warna violet yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram positif, sedangkan E. coli berbentuk basil dengan warna merah yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram negatif. Pada sampel yang kedua yaitu sampel suspensi campuran bakteri E. coli dan B. subfilis dapat teramati dengan ciri bakteri B. subfilis berbentuk basil dengan warna violet yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram positif. Sedangkan bakteri E. coli sama seperti sampel pertama.

Beberapa perbedaan sifat yang terlihat antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif yaitu bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna violet sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini akan berwarna biru atau violet di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini di dasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal di banding bakteri gram negatif sehingga bakteri gram positif dapat mempertahan warna ungu.

 

VIII. Simpulan

Dapat mengamati dua kelompok bakteri yaitu gram positif dan gram negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan gram, dengan hasil bakteri S. Aureus dan bakteri B. subfilis sebagai bakteri gram positif, lalu bakteri E. coli sebagai gram negatif.

Dapat memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam proses tersebut yang dapat di lihat dari pewarna yang bereaksi dengan sel bakteri. 

DAFTAR PUSTAKA 

Aryulina, Diah.2004.Biologi Umum. Jakarta : Erlangga

Campbell, Nell.2003. Bilogi Edisi Kelima Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

Dwidjoseputro, D.2005.Dasar - Dasar Mikrobiologi.Malang: Penerbit Djambatan.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor : IPB

James, Joyce. 2002. Prinsip - Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Jakarta : Erlangga

Karmana, Oman. 2008. Biologi. Jakarta : PT Grafindo Media Pratama.
Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali. Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Siswaya,Yoanne.2014.Teknik Kultur Secara Aseptik. Tersedia online di http://www.academia.edu/6138539/Praktikum_2 [Diakses pada tanggal 8 Maret 2015].

Setyowati, Suparni.2009.Absorbsi. Tersedia online di http://www.chem-is- try.org/materi_kimia/kimia-industri/teknologi-proses/absorbsi/ [Di akses pada 8 Maret 2015].

Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta : Erlangga.